Occurrence and composition of class 1 and class 2 integrons in clinical and environmental O1 and non-O1/non-O139 Vibrio cholerae strains from the Brazilian Amazon

This study identified and characterised class 1 and 2 integrons in clinical and environmental Vibrio cholerae O1 and non-O1/non-O139 strains isolated from the Brazilian Amazon. The aadA2 and aadA7 gene cassettes were found in class 1 integrons in two genotypes of environmental V. cholerae non-O1/non-O139. Empty integrons were found in strains from the Brazilian cholera epidemic. A class 2 integron was detected in one strain from the V. cholerae Amazonia lineage harbouring sat1 and aadA1 genes. All isolates were resistant to aminoglycosides, indicating aadA functionality. These findings suggest that environmental bacteria act as cassette reservoirs that favour the emergence of resistant pathogens.

Expressão de genes de resistência intrínsecos e adquiridos em Pseudomonas aeruginosas e funcionalidade de cassetes gênicos associados a integrons classe 1 / Expression of genes of intrinsic and acquired resistance in Pseudomonas aeruginosa and functionality of gene cassettes associated with class 1 integrons

Integrons classe 1 e cassetes gênicos vêm sendo apontados como importantes mecanismos para a emergência da multi-resistência em bactérias Gram-negativas, contudo, a maioria dos estudos não acessa a funcionalidade destas estruturas. Em Pseudomonas aeruginosas, os conhecidos sistemas de efluxo MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM contribuem de forma significativa para multi-resistência, e a porina OprD tem sido considerado o principal determinante intrínseco de resistência a imipenem nesta espécie. Isolados clínicos de P. aeruginosas, Klebsiella pneumonie e Vibrio cholerae carreiam com freqüência integrons classe 1. O presente estudo tem como objetivo determinar o padrão de transcrição/expressão dos principais determinantes da multi-resistência em P. aeruginosas, incluindo mecanismos intrínsecos e adquiridos. Além disto, objetivou-se acessar o papel dos integrons e cassetes gênicos neste fenótipo de resistência em outras espécies, V. cholerae e K. pneumoniae, 17 isolados clínicos multi-resistentes de P. aeruginosas carreando íntegrons classe 1 com distintos arranjos gênicos foram analisados. Todo os arranjos gênicos, o gene da porina OprD e os genes reguladores das bombas foram seqüenciados. A transcrição de vários arranjos gênicos clonados (aacA4-blaoxa-2-gcuD, dfrB7-aacA4, dfrB7-aacA4-blaoxa-2 e aadB-aacA4-blacarb-4), dos quatro principais sistemas de efluxo (mexAB-oprM, mexAB-oprM, mexCD-oprJ, mexXY-oprM e mexEF-oprN) e do gene da porina oprD foi avaliada por PCR em tempo real. O padrão de transcrição do arranjo gcu14-blaGes1/aacA4 presente em PS1 e PS26 também foi determinado por PCR em tempo real e Northem blot. A expressão dos novos alelos de cassetes Gênicos encontrados em V. cholerae (qnrVC1), K. pneumoniae(arr-5) e P. aeruginosa (arr-4) foi verificada através do fenótipo de resistência e da busca de sinais traducionais presentes nestas estruturas. A maioria dos isolados apresentou aumento nos níveis de transcrição de mex XY, enquanto que mexEF-oprN estava reprimida em todos os isolados MexCD apresentou transcrição basal em 8/17 amostras e 4/17 estavam com transcrição elevada. OprD teve uma transcrição diminuída em grande parte dos isolados, corroborando com a resistência a imipenem observada, e alguns isolados com transcrição aumentada da oprD apresentavam várias mutações no gene estrutural. De um modo geral, os perfis de resistência estavam de acordo com a expressão de todas as bombas, contudo, a correlação entre a transcrição da bomba e a integridade de seu gene regulador não foi observada, indicando a participação de reguladores adicionais para todas estas quatro bombas. Há uma correlação entre o efeito da posição do cassete e o nível de transcrição, já que cassetes mais próximos do promotor Pc eram até 3X mais transcritos que cassetes mais distais. A influência da configuração do Pc nos níveis de transcrição também foi determinada, de forma que a versão forte foi responsável por um aumento de 2X em relação à versão fraca considerando o mesmo cassete gênico em uma mesma posição (aacA4). Foi mostrado que o cassete fusionado blages-1/aacA4 presente em PS1 e PS26 era transcrito como um RNAm policistrônico, e foi possível observar o efeito da posição do cassete. O fenótipo de resistência das transformantes corroborava com a expressão dos arranjos gênicos clonados. Promotores internos foram caracterizados em vários cassetes, e PaadB e Pcarb-4 mostraram ser funcionais. A presença da ORF-11 no sítio att/1 de vários dos cassetes gênicos e o fenótipo de resistência destes isolados sugere fortemente o papel desta seqüência regulatória putativa em eventos pós-transcricionais. Esta seqüência regulatória também foi identificada nos novos alelos descritos, qnrVC1, arr-4 e arr-5, e apóia o perfil de resistência observados nos isolados selvagens de V. cholerae, P.aeruginosa e K.pneumoniae. Além disso, foi identificada, pela primeira vez, uma ORF-11-like em potencial (ORF-15) que poderia aumentar a expressão dos cassetes dfrB7. Em conclusão, este estudo foi original na determinação do padrão de transcrição de cassetes fusionados, e no estabelecimento do efeito da posição do cassete no nível de transcrição em isolados selvagens de P. aeruginosa (PS1 e PS26). Verificou-se que a multi-resistência destes isolados era multifatorial, e que uma regulação pós-transcricional influenciava o fenótipo final de resistência. Considerando os isolados de P. aeruginosa, os cassetes gênicos em integrons de classe 1 tinham um papel secundário no perfil de resistência.

Caracterização genética de integrons classe 1 em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa da região Amazônica / Genetic characterization of integrons classroom 1 in isolated physicians of aeruginosa Pseudomonas of the Amazon region

Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram-negativo capaz de explorar diferentes nichos e de utilizar vários compostos como fonte de energia.Esta espécie apresenta tolerância a diversas condições ambientais,o que contribui para seu sucesso como um patógeno oportunista. P.aeruginosa é considerada um dos mais importantes patógenos nosocomiais.A presença de determinantes intrínsecos, mutações e a transferência horizontal de genes são responsáveis pela resistência que P.aeruginosa apresenta a uma grande variedade de antibióticos,incluindo aqueles de última geração.Integrons são elementos genéticos que capturam e expressam cassetes gênicos.Várias classes de integrons têm sido identificadas.Integrons classe 1 são os mais conhecidos entre isolados clínicos e têm sido extensivamente estudados.São caracterizados por 2 segmentos conservados e...O objetivo deste trabalho foi caracterizar integrons classe 1 encontrados...Dos isolados positivos para integron classe 1,nós detectamos um total de 15(34por cento)que não carreavam nenhum cassete gênico,dos quais 14 eram multiresistentes.Análises por RFLP da região variável dos integrons revelaram algumas estruturas idênticas,bem como perfis distintos indicando heterogeneidade entre estas regiões de cassetes.A análise de seqüência determinou a presença de 10 cassetes gênicos diferentes nos integrons,incluindo alguns descritos pela primeira vez no Brasil(blaGES-3,dhfrXVb,aadB)assim como uma nova orf(orf126)e um novo alelo dfr(dfrII-like).Além disso,este estudo mostrou pela primeira vez a associação do cassete gênico blaCARB-4 com integrons classe 1.aacA4 foi o gene mais freqüente encontrado nos integrons classe 1,seguido por blaOXA-2.Dez genótipos diferentes, determinados por PFGE,estavam circulando em 5 hospitais da cidade de São Luís,e a maioria dos isolados clonais carreavam o mesmo arranjo de integrons.Multiresistência foi observada em todos os isolados com integrons caracterizados,contudo,nenhuma forte correlação foi observada entre a presença do integron e a multiresistência.Também foi determinada a presença de mais de um integron em um isolado.Em conclusão,a grande proporção de integrons classe 1 encontrados entre nossos isolados não é responsável pela multiresistência,a qual provavelmente é conseqüência de vários mecanismos.Este estudo mostrou a ocorrência de integrons classe 1 e o conteúdo e organização dos cassetes gênicos em isolados de P.aeruginosa provenientes de hospitais da Amazônia brasileira.